Las herramientas CRISPR-Cas y la pandemia COVID-19

Lluís Montoliu
Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)
Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Raras (CIBERER-ISCIII), Madrid

montoliu@cnb.csic.es

@LluisMontoliu

En octubre de 2020, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna recibieron el Premio Nobel de Química a por haber propuesto y desarrollado un método de edición genética con las herramientas CRISPR-Cas en 2012. Los sistemas CRISPR habían sido descritos 7 años como parte de un sofisticado sistema de defensa adaptativo que usan las bacterias para luchar contra los virus que las acechan, gracias al trabajo de Francis Mojica, microbiólogo de la Universidad de Alicante, y otros pioneros.

Las herramientas CRISPR-Cas son extraordinariamente versátiles. Aunque su actividad más conocida es el corte de la doble cadena del ADN, dirigido por una molécula de ARN, lo cual activa los mecanismos de reparación endógenos celulares que acaban editando el gen seleccionado, desde 2017 sabemos que existen sistemas CRISPR-Cas capaces de cortar específicamente ARN. Esta nueva actividad ha permitido desarrollar aplicaciones de DIAGNÓSTICO y TRATAMIENTO de la pandemia COVID-19 con las herramientas CRISPR-Cas.

Diagnóstico de la COVID-19 con CRISPR

En 2017 se descubrió una nueva nucleasa Cas, llamada Cas13a, capaz de cortar ARN guiada por otra molécula de ARN complementario (1). También se descubrió que al producirse el corte del ARN diana la Cas13a perdía su especificidad y empezaba a cortar todos los ARN existentes en la mezcla, in vitro, en el laboratorio. El laboratorio de Feng Zhang aprovechó tal circunstancia para desarrollar un nuevo sistema de diagnóstico, al introducir unas moléculas de ARN indicadoras, de pequeño tamaño, con un extremo unido a un fluróforo y otro extremo unido a un inhibidor de la fluorescencia. Cuando ambos dos extremos estaban cerca, en la misma molécula, no se producía fluorescencia. Pero cuando la Cas13a se activaba, tras identificar a su ARN complementario, entonces cortaba estas moléculas de ARN indicadoras y aparecía la fluorescencia. La técnica era muy sensible y fue bautizada con el acrónimo SHERLOCK [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing] (2).

El laboratorio de Jennifer Doudna describió en 2018 una actividad análoga en la nucleasa Cas12a, que corta ADN de forma específica, guiada por una molécula de ARN, pero que al encontrar a la secuencia complementaria también adquiere una actividad como nucleasa inespecífica capaz de cortar cualquier molécula de ADN de cadena sencilla. La adición de moléculas de ADN indicadoras (preparadas como los ARN indicadores anteriores) permitía convertir a la nucleasa Cas12a también en un sistema de diagnóstico, que bautizaron como DETECTR [DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter] (3).

El primero en aplicar SHERLOCK para detectar el coronavirus SARS-CoV-2, causante de la epidemia COVID-19, fue el propio Feng Zhang, en marzo de 2020, al adaptar el protocolo a tiras reactivas diagnósticas con las que era posible detectar varios genes del virus hasta concentraciones de 10 copias del virus por microlitro (4). La respuesta de DETECTR no se hizo esperar y unos meses después apareció un sistema de diagnóstico alternativo de SARS-CoV-2, con sensibilidad similar, basado en Cas12a que tenía primero que retrotranscribir el ARN genómico del coronavirus a ADN, amplificarlo en condiciones isotérmicas (con la técnica LAMP [Loop-mediated isothermal amplification]) y finalmente usar la nucleasa CRISPR para detectarlo (5).

Estas estrategias de diagnóstico de la COVID-19 eran mucho más rápidas que el protocolo de RT-PCR habitual (30-60 minutos de SHERLOCK/DETECTR frente a las 2-3 horas mínimo requeridas por la RT-PCR), con una sensibilidad algo menor (hasta 10 copias del virus/microlitro, frente a 1 copia del virus/microlitro para la técnica RT-PCR) y, especialmente, mucho más sencillas de aplicar. No requerían ni equipamiento específico, ni robots, tan solo un calefactor, unos tubos, unas micropipetas y unas tiras reactivas. La respuesta era naturalmente qualitativa, y no cuantitativa, como sí se obtiene en la RT-PCR.

La facilidad de uso llevó al equipo de Feng Zhang a desarrollar un sistema de diagnóstico POC (point of care) simplificado, basado en la nucleasa Cas12b, de comportamiento similar a la Cas12a (6), capaz de instalarse en cualquier sitio, con una sensibilidad algo menor (100 copias del virus/microlitro), que recibió la aprobación de emergencia por parte de la agencia reguladora norteamericana FDA a principios de mayo de 2020.

A finales de 2020, el laboratorio de Jennifer Doudna volvió a sorprender a la comunidad científica con la puesta a punto de un nuevo sistema de diagnóstico de la COVID-19, basado en Cas13a, cuya lectura de fluorescencia podía realizarse en apenas cinco minutos a través de la cámara fotográfica incorporada en los teléfonos móviles de última generación (7).

Tratamiento de la COVID-19 con CRISPR

En 2018 se describió un nuevo sistema CRISPR-Cas con la nucleasa Cas13d (originalmente llamada CasRx), capaz de cortar específicamente moléculas de ARN guiada por una pequeña molécula de ARN, pero sin la actividad inespecífica descrita para otras nucleasas similares, lo cual permitía imaginar tratamientos antivirales directos contra el coronavirus, aprovechando su genoma de ARN (8).

La primera demostración experimental de que el sistema CRISPR-Cas13d podría usarse para atacar directamente al genoma ARN del coronavirus vino de la mano de un grupo de Stanford, en California (EEUU), que utilizó unas células humanas previamente transfectadas establemente con el gen de la Cas13d para probar en ellas la capacidad de degradar genomas virales de ARN tanto del virus de la gripe como del SARS-CoV-2 (9). Naturalmente esta estrategia difícilmente podría usarse en la clínica, pues exige modificar genéticamente a las células humanas con una construcción génica de Cas13d, lo cual era su principal limitación.

Para resolver el problema principal (la entrega de Cas13d y de la guía ARN específica, complementaria a zonas conservadas, menos variables, del genoma ARN del coronavirus) otro equipo acaba de demostrar que es posible encapsular todo el sistema CRISPR-Cas (en este caso usando la nucleasa Cas13a, que, in vivo, no parece mostrar la inespecificidad de corte que muestra in vitro) con nanopartículas y, a través de la vía aérea (por inhalación de estas nanopartículas) llevar el sistema a las células pulmonares infectadas con el coronavirus. Los primeros resultados de esta estrategia, realizada en un modelo de ratón susceptible de ser infectado por SARS-CoV-2 y en hámsters, ofrecen resultados prometedores, tanto con la infección mediada por el coronarivus SARS-CoV-2 como con el virus de la gripe (10).

Referencias

1. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C, Bhattacharyya RP, Livny J, Regev A, Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, Zhang F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442.
2. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 2019 Oct;14(10):2986-3012.
3. Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439.
4. https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-19%20detection%20(updated).pdf
5. Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, Zorn K, Gopez A, Hsu E, Gu W, Miller S, Pan CY, Guevara H, Wadford DA, Chen JS, Chiu CY. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020 Jul;38(7):870-874.
6. Joung J, Ladha A, Saito M, Segel M, Bruneau R, Huang MW, Kim NG, Yu X, Li J, Walker BD, Greninger AL, Jerome KR, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. medRxiv. 2020 May 8:2020.05.04.20091231.
7. Fozouni P, Son S, Díaz de León Derby M, Knott GJ, Gray CN, D’Ambrosio MV, Zhao C, Switz NA, Kumar GR, Stephens SI, Boehm D, Tsou CL, Shu J, Bhuiya A, Armstrong M, Harris AR, Chen PY, Osterloh JM, Meyer-Franke A, Joehnk B, Walcott K, Sil A, Langelier C, Pollard KS, Crawford ED, Puschnik AS, Phelps M, Kistler A, DeRisi JL, Doudna JA, Fletcher DA, Ott M. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 2021 Jan 21;184(2):323-333.e9. doi: 10.1016/j.cell.2020.12.001. Epub 2020 Dec 4.
8. Nguyen TM, Zhang Y, Pandolfi PP. Virus against virus: a potential treatment for 2019-nCov (SARS-CoV-2) and other RNA viruses. Cell Res. 2020 Mar;30(3):189-190.
9. Abbott TR, Dhamdhere G, Liu Y, Lin X, Goudy L, Zeng L, Chemparathy A, Chmura S, Heaton NS, Debs R, Pande T, Endy D, La Russa MF, Lewis DB, Qi LS. Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza. Cell. 2020 May 14;181(4):865-876.
10. Blanchard EL, Vanover D, Bawage SS, Tiwari PM, Rotolo L, Beyersdorf J, Peck HE, Bruno NC, Hincapie R, Michel F, Murray J, Sadhwani H, Vanderheyden B, Finn MG, Brinton MA, Lafontaine ER, Hogan RJ, Zurla C, Santangelo PJ. Treatment of influenza and SARS-CoV-2 infections via mRNA-encoded Cas13a in rodents. Nat Biotechnol. 2021 Feb 3. doi: 10.1038/s41587-021-00822-w. Epub ahead of print. PMID: 33536629.